本方案描述標準、老式但可靠的方法，用於克隆含有不相容的突出末端的線性DNA片段。

用兩種合適的限制性內切核酸酶消化載體（10μg） 和外源DNA。製備閉合環狀質粒軟體用於定向克隆，透過兩種限制性內切核酸酶在不同序列切割，產生不同的末端。只要可能。

儘量避免使用多克隆位點上切割序列相互之間位於12bp 以內的兩種限制性內切核酸酶，因為在其中一個位點被切割後，第二個位點將太接近線性DNA的末端，從而不利於第二種酶的有效切割。

New England Biolabs 公司目錄的附錄有一張極好的列表， 顯示了不同限制性內切核酸酶切割靠近DNA分子末端位點的效率。閱讀製造商的說明，以確定兩種限制性內切核酸酶在相同的酶切緩衝液中是否是最優條件下工作。

如果是這樣的話，可以用兩種酶同時消化裁體DNA。如果兩種限制性內切核酸酶需要不同的緩衝液，最好分步酶切。在這種情況下，應首先使用鹽濃度低的酶。在反應結束時，取一份DNA用凝膠電泳法分析，以確認所有的質粒DNA由環形轉變為線性分子。然後適當調整鹽濃度，並新增第二種酶。

透過酚：氯仿抽提純化消化後的外源DNA，標準乙醇沉澱。根據實驗情況，分離外源DNA的目的片段可能是必要或適當的，透過中性瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，按第2章方案1和方案3中所述進行，這個純化步驟一般是在限制性酶切外源DNA後產生多個可以連線到載體的片段時才進行。