論文題目：Testis formation in XX individuals resulting from novel pathogenic variants in Wilms’ tumor 1 (WT1) gene | PNAS（腎腫瘤1(WT1)新致病變異體引起XX個體睪丸形成的研究）

文章轉載 | 非編碼RNA研究園地（公眾號ID:ZKQF-RNA

01長出睪丸的女嬰

Alice（化名）是一個出生在巴西的小女孩，在她1歲時，醫生髮現她的生殖系統出現了異常：

Alice的子宮只有半個，體記憶體在睪丸組織，包括睪丸支援細胞和曲細精管。

在她10歲時，Alice體內的雌激素水平遠低於雄性激素，而且似乎將一直維持在較低的水平。

但她的父母並非近親結婚，對她的外周血淋巴細胞的分析也顯示，她體內的染色體數目是正常的，而性染色體為XX。

Alice所患的疾病屬於“

性別發育異常”（Differences in sexual development，簡稱DSD）

。平均每2500~4000人中，會出現一位DSD患者。

研究人員最開始一度認為Alice和大部分患者一樣，患病的原因是本應該存於在Y染色體上的SRY基因，因為染色體交叉互換轉移到了X染色體上。

而SRY基因對於開啟男性生殖系統的發育具有關鍵作用，這一基因的轉移也是導致女性患DSD的主要原因。

但檢測結果卻顯示，

Alice的基因組上並不存在SRY基因易位

。因此，研究人員搜尋了Alice基因組中其他和這一疾病相關的突變，最終找到了一個可疑的基因。

2018年，聖保羅大學的研究人員將這一研究結果發表於《臨床遺傳學》（Clinical Genetics），

證實Alice的患病原因罕見地與一個存在於常染色體上的癌症相關基因——WT1基因的突變有關。

02結果

所有患有TDSD/OTDSD的個體均為46，XX，具有不同程度的病毒。患者1，2，3出現46，XX TDSD，其外生殖器範圍從典型的男性習慣性到模稜兩可。

病人4呈46，XX型OTDSD。患者5a和5b分別為46，XX OTDSD和Meacham綜合徵伴46，XY性腺發育不全的同胞對。患者6具有典型的男性習慣性，表現為46，XX型TDSD。

患者7為先天性膈疝，外生殖器陽性，懷疑46，XX OTDSD。患者1，3，4，5a和5b的性腺組織學（患者7的腎臟超聲檢查是可用的。

WT1基因ZF4的致病變異與46，XX TDSD/OTDSD和46，XY Meacham綜合徵有關。

我們從78個不相關的46，XX TDSD/OTD個體（8。97%）中鑑定出7個家族，攜帶5個不同的WT1變異體（P。Arg495Gly［例1］；p。Pro481Leufs*15［患者2］；p。Arg495Gln［患者3，4，5a，5b］；Lys491Glu［病人6］；p。Ser478Thrfs*17［患者7］；在家庭5，受影響的XY同胞出現Meacham綜合徵（病人5b）。

所有變異體都聚集在脊椎動物物種高度保守的區域，該區域編碼蛋白質的ZF 4。

沒有WT1在400多個已知的可育個體(內部對照)中發現了變異體，公共資料庫(exac資料庫)中也沒有變異體(exac資料庫)。

Http：//exac。broadinstitute。org和gnomAD資料庫Https：//gnomad。broadinstitute。org）。

在我們的佇列中觀察到與46，XX DSD相關的LOF和非同義變體的頻率的Fisher‘s精確檢驗（兩尾），而在我們的佇列中與罕見的（較小的等位頻率［MAF］<0。01%）LOF和非同義變體的LOF和非同義變體相比WT1來自對照個體的基因，顯示出這些基因的高度富集。

WT1患者佇列中的變體（P < 1。8 × 104）。

在六個家庭中，繼承的方式是重新確定的，而在剩下的一個病例(病人6)中，這是未知的，因為父母的DNA無法進行研究。

與對照個體中非同義/LOF變異體的頻率相比（0/522，Http：//denovo-db。gs。washington。edu/denovo-db），DSD佇列對於denovo變體（P = 4。1 × 106）。

此外，所有家族都是不相關的，來自地理上不同的地區，不包括罕見變異體的方正效應。

所有46，XX名兒童SRY-陰性，外顯子資料分析沒有發現任何其他可能的致病變異，在已知的性別決定/DSD基因。

ClinVar（Https：//www。ncbi。nlm。nih。gov/clinvar涉及WT1 ZF4的致病變種（P。Pro487Ser，

變異ID：543123；p.Ser488Asn[x2]，變異ID：578607；p.Lys491Arg，變異ID：655847；p.His505Gln，變異ID：664113)與WT1致病變種的典型臨床特徵(Denys-Drash綜合徵、Wilms腫瘤、變異症、生殖器異常、精神發育綜合徵、Frasier綜合徵)有關。

在我們的研究和提交給ClinVar資料庫的患者中存在致病變異體，並且在公共資料庫中沒有類似的變化，這突出了WT1的ZF4的功能重要性。

Arg495Gly改變了蛋白質的生物活性

In蛋白模型預測變異體對WT1的ZF 4結構穩定性有嚴重的有害影響。

本文利用Arg495Gly變異作為概念證明，研究了WT1基因ZF4突變的功能後果，並透過體外和原位檢測探討了其可能的發病機制。

用瞬時轉染法檢測WT1蛋白在人胚腎HEK 293-T細胞中的亞細胞定位。

我們觀察到突變體和WT蛋白都有很強的核定位。據報道，ZF 4可以穩定ZF 2和ZF 3的DNA結合。

因此，我們透過電泳遷移率轉移試驗（EMSA）研究了突變蛋白與WT1靶共識序列結合的能力，發現突變蛋白保持了dna結合活性。

Arg495Gly變異體可能是由於卵巢內睪丸特異性通路的不適當啟用所致，直接啟用睪丸基因或間接干擾正常抑制睪丸形成的通路。

用報告法檢測瞬時轉染的HEK 293-T細胞，wt1p。Arg 495Gly顯示睪丸特異性增強子的活性顯著增加。

SOX 9 （樂購）與輔助因子GATA 4/FOG 2和NR5A1。Arg 495Gly還顯示出卵巢特異性啟用的劑量依賴性減少。FOXL2啟動子。

以前有人認為WT1和FOXL2蛋白可能相互作用，我們發現突變的WT1蛋白與FOXL2蛋白有類似野生型的結合。

將WT1p。Arg495Gly瞬時轉染人顆粒Kgn-1細胞系，可使與支援細胞形成相關的內源性轉錄產物（SOX 9， NR5A1， DMRT 1），而內源性顆粒細胞轉錄本的表達水平（FOXL2、β連環素， FST）保持不變。

我們觀察到內源性的上調。SOX 9轉染Kgn-1細胞後，ZF 4（WT1p。Arg 495*和WT1p。Lys491Glu）表達受到影響。內源性水平FOXL2保持不變。

ZF 3（WT1p。Gln 437Lys）的一個變異體在一對46，XX對患有腎臟疾病的同卵雙生子中被報道，但沒有發現病毒感染的證據。

值得注意的是，SOX 9該變異體轉染後表達未上調，與臨床表型一致。

03討論

β-catenin在人和小鼠卵巢發育過程中起重要作用。Rspo/wnt維持β-catenin訊號通路不僅支援或促進卵巢通路，而且抑制SOX 9的表達和相通路。

在體外，我們觀察到zf 4變體不僅增加了相關的啟用SOX 9增強子，但也顯示與β-catenin蛋白結合，而WT蛋白沒有。值得注意的是，ZF 3（p。Gln437Lys）中有一個變異體，它與腎臟疾病有關，但在XX個體中與DSD無關，與β-catenin蛋白的相互作用水平較低，可與WT1-WT相媲美。透過改變WT1的相互作用能力，

並明顯干擾β-catenin的關鍵親卵巢因子和抗睪丸因子，ZF 4變異體可能導致SOX 9表達上調。

基於這些資料，我們提出了一種解釋攜帶WT1 ZF 4變異體的XX個體睪丸形成的機制。

突變體WT1與β-catenin蛋白的相互作用導致β-catenin的固存，從而對卵巢前通路的啟用產生負面影響和/或導致SOX 9的抑制。

因此，在XX染色體背景下，睪丸訊號級聯被啟用。然而，WT1的生物學是高度複雜的，多個異構體表現出明顯的亞核定位，在轉錄水平和轉錄後水平上具有不同的調節特性。

不能排除突變體WT1可能透過RNA和染色質修飾等其他機制在XX性腺中誘導睪丸的形成。

總之，雖然WT1在兩性性腺發育中具有複雜的早期作用，但與WT1的其他變體相比，我們認為在WT1的ZF4結構域中發現的變異可能導致在XX性腺胚胎髮育過程中對雌性途徑的直接或間接抑制和啟用。

因此，這些突變是46，XX SRY陰性(O)TDSD的一個相對常見的原因。