正當哈布斯堡王朝的政策和反宗教改革變換波希米亞的宗教、政治和文化面貌之時，三十年戰爭在歐洲大部分地區蔓延，其中也包括了波希米亞王室的土地。作為歐洲最後一次重大的宗教戰爭，三十年戰爭由1618年的波希米亞起義引發，戰火遍及這個大陸直到1648年，從布拉格的一次丟擲窗外事件擴充套件為德國新教統治者與哈布斯堡家族的神聖羅馬帝國皇帝及其天主教盟友組成的聯盟之間的鬥爭。由此，貫穿它的四個發展階段，三十年戰爭展現為牽涉歐洲幾大王朝的權力鬥爭。

斐迪南二世得到了一名有經驗的軍事將領，波希米亞貴族阿爾布雷希特馮華倫斯坦（瓦爾德什泰恩）主動提出以2萬名土兵支援這位皇帝的天主教事業。華倫斯坦是一名在兄弟會經營的學校中受過教育的沒落貴族，在1609年改信了天主教。華倫斯坦希望透過協助皇帝及其天主教盟友來擴張他所擁有的土地，他很快展露出作為一名帝國軍隊優秀將領的才能，並由此獲得嘉獎。諸多軍事勝利和對波希米亞北部地區的吞併為華倫斯坦在17世紀20年代中期贏得了弗裡德蘭公爵的名銜。隨著丹麥加入戰鬥站在新教君主這一邊，而華倫斯坦幫助擊敗了克里斯蒂安四世的丹麥軍隊，他的軍事作用和威望隨之增長，為此華倫斯坦還被賜予梅克倫堡公國。

1629年，斐迪南二世頒佈了歸還教產敕令，重新激發了宗教爭論，該敕令命令歸還自1552年以來所有被挪用的天主教土地，並且透過禁止加爾文教徒進行禮拜來脅迫新教教徒。隨後的一年，擔心華倫斯坦的動機並且對他的僱傭軍規模有所顧慮的天主教和新教君主說服皇帝解除了華倫斯坦的軍事指揮官職務。然而，瑞典人對帝國將軍蒂利伯爵的勝利一一蒂利本人也於1632年在萊赫陣亡一一以及薩克森人對波希米亞的入侵，迫使皇帝恢復華倫斯坦的統帥職位。曾經佔領布拉格的薩克森人被趕出了波希米亞，隨後華倫斯坦轉向與古斯塔夫阿道夫二世統帥的瑞典軍隊作戰。華倫斯坦於1632年11月在昌岑的一次重大戰役中與瑞典人遭遇，儘管陷入困境的華倫斯坦被迫退至波米亞，新教事業卻由於古斯塔夫阿道夫戰死而遭到了重大挫折。出於追逐他自己的利益，華倫斯坦開啟了與薩克森還有法國、瑞線和一些捷克流亡者的秘密協商，很有可能是希望獲得他自己的獨立含地，也可能是為了追逐波希米亞王位。帝國當權者對華倫斯坦的野心和動機漸生懷疑，皇帝再一次解除他的統帥職務，同時叛國罪的指控地開始流傳。1634年2月25日，在海布要塞，華倫斯坦被他自己手下的名軍官謀殺，這麼做是出於對統帥叛國的憤怒。

對於波希米亞王國來說，三十年戰爭的最後階段以瑞典16391642年在波希米亞和1642年在摩拉維亞的軍事行動為標記。哈布斯堡家族與特蘭西瓦尼亞協商了一份和約，瑞典人離開了摩拉維亞。1648年，瑞典軍隊回到布拉格，圍攻這座城市，在這個過程中掠奪布拉格城堡和魯道夫二世的藝術收藏。學生志願兵把守橫跨伏爾塔瓦河的石橋，抵抗瑞典人，而猶太人團體保衛了部分堿牆，並且最終為抵抗努力提供了幫助。腓特烈三世用臨時減輕稅負和兌付被拖延的軍需物資款項來獎賞布拉格的猶太人，不過這些福利被1648年的猶太人特許證抵消，該特許證對猶太人的權利和特權設定了限制。

1648年，《威斯特伐利亞和約》的簽訂正式結東了三十年戰爭，而在神聖羅馬帝國，《奧格斯堡條約》（1555年）的條款被恢復並擴充套件以包含加爾文教派。在“誰的統治，誰的信仰＂（ curius regio， eius religio）的原則指導下，宗教和平允許單個統治者決定整個人口的宗教信仰。儘管農民沒有權利去選擇，其他國民可以皈依官方信仰或者離開。對捷克流亡者來說，將1634年定為基準年意味著他們將不能回到他們的祖國。天主教在波希米亞的勝利推動了這個王國反宗教改革的成功，不過憑藉與薩克森的協議，西里西亞的路德教派信徒保住了禮拜的權利。

對於波希米亞來說，三十年的戰事帶來了經濟混亂，同時因為衝突、饑荒、疾病和移民或流亡，人口數量急劇減少。由於士耳其戰爭期間匈牙利的分裂，波希米亞成為哈布斯堡王朝各領地中最大的一個，即使是在1635年失去上下西里西亞的情況下。在城鎮裡，由於戰爭對城市及其經濟活動的挫傷，許多市民面臨著貧困或財務困境。對於波希米亞農村來說，土地向教會或者高等貴族的轉讓使得低等貴族佔有的土地減少到10％，而僅僅一個世紀前，他們還在佔有土地總和上勝過大貴族。差不多90％的人口以從屬農民的身份生活在天主教會和貴族階層佔有的土地上，同時“二等農奴”在中歐的延續意味著在西歐已經消失或者即將被廢棄的封建習俗的留存。作為1680年失敗的農民起義的結果，利奧波德一世（1657~-1705年在位）再次確認了長期存在的勞役（ robota）需求，那就是要求農民每週按慣例有三天為地主服務，或者在農忙期間幹滿七天。

在文化背景上，波希米亞與歐洲天主教國家的重新連線使得巴洛克風格和其他影響滲入捷克國士。在反宗教改革的精神裡，復興的天主教堂推動了17世紀晚期的巴洛克風格，透過一種甚至可以觸及普羅大眾的強大而有活力的途徑，把它作為激勵宗教熱情的手段。波希米亞的巴洛克建築展現了義大利和奧地利大師的格調，不過也有本地建築師的靈感，比如克里斯托弗·丁岑霍菲和他的兒子基連·伊格納茲丁岑霍菲，其中位於布拉格小城由後者設計的聖尼古拉教堂被認為是波希米亞巴洛克傑作。哈布斯堡統治者利奧波德一世和約瑟夫一世（1705-1711年在位）統治下的巴洛克時期在藝術上是多產的，不過主要的貢獻在藝術和建築領域，而不是文學領域。